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May 26, 2023

Analyse structurale et principes architecturaux du curli amyloïde bactérien

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2822 (2023) Citer cet article

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Deux décennies se sont écoulées depuis la proposition initiale selon laquelle les amyloïdes ne sont pas seulement des sous-produits (toxiques) d'une cascade d'agrégation involontaire, mais qu'ils peuvent également être produits par un organisme pour remplir une fonction biologique définie. Cette idée révolutionnaire est née de la prise de conscience qu'une grande partie de la matrice extracellulaire qui retient les cellules Gram-négatives dans un biofilm persistant est composée de fibres protéiques (curli; tafi) avec une architecture cross-β, une cinétique de polymérisation dépendante de la nucléation et une propriétés tinctoriales amyloïdes. La liste des protéines dont il a été démontré qu'elles forment des fibres amyloïdes dites fonctionnelles in vivo s'est considérablement élargie au fil des ans, mais les informations structurelles détaillées n'ont pas suivi à un rythme similaire, en partie à cause des barrières expérimentales associées. Ici, nous combinons une modélisation AlphaFold2 étendue et une cryo-microscopie à transmission électronique pour proposer un modèle atomique des protofibrilles curli et de leurs modes d'organisation supérieurs. Nous découvrons une diversité structurelle inattendue de blocs de construction curli et d'architectures de fibrilles. Nos résultats permettent une rationalisation de l'extrême robustesse physico-chimique des curli, ainsi que des observations antérieures de la promiscuité curli inter-espèces, et devraient faciliter de nouveaux efforts d'ingénierie pour élargir le répertoire de matériaux fonctionnels à base de curli.

Bien qu'autrefois considéré comme une cible invraisemblable pour la biologie structurale, les développements récents de la cryo-microscopie électronique (cryoEM) et du traitement hélicoïdal ont facilité la détermination de la structure des fibrilles amyloïdes à une résolution quasi atomique1. Une pléthore de structures déterminées expérimentalement d'amyloïdes générés in vitro et isolés ex vivo a révélé une diversité structurelle déconcertante d'architectures de fibres, y compris le concept de polymorphes de fibres ou de souches de séquences par ailleurs identiques ou étroitement apparentées2,3,4,5. Malgré les différences dans l'architecture des proto-fibrilles et la symétrie hélicoïdale des fibres, la plupart des structures amyloïdes partagent plusieurs caractéristiques conservées qui nous permettent d'élargir la définition du pli amyloïde au-delà de l'adage bêta croisé traditionnel. Au meilleur de notre connaissance, toutes les structures amyloïdes actuellement décrites consistent en un empilement répétitif d'arrangements de brins β complexes, serpentins et plans qui sont stabilisés par des motifs de fermeture à glissière stériques dans lesquels les chaînes latérales de résidus interdigités forment de vastes Van der Waals, électrostatiques, hydrophobes et hydrogène. contacts de liaison. L'empilement axial de peptides planaires par amarrage brin-brin et la formation de β-arcade entraînent la formation de protofibrilles, généralement suivie par l'enroulement hélicoïdal de plusieurs protofibrilles dans une superstructure hélicoïdale remarquablement stable. C'est précisément cette symétrie hélicoïdale qui a été exploitée avec grand succès dans les approches cryoEM modernes pour résoudre les détails structurels d'un large éventail de structures amyloïdes.

La plupart de ces structures appartiennent à une sous-famille d'espèces amyloïdes qui sont corrélées à une foule de maladies (neuro) dégénératives, systémiques de dépôt et de mauvais repliement. Pour cette raison, ces protéines amyloïdogènes sont familièrement appelées amyloïdes pathologiques (AP). Ces amyloïdes associés à la maladie ont en commun qu'ils représentent un événement de mauvais repliement et d'agrégation non fonctionnel et hors voie de protéines ou de fragments de protéines déstabilisés pour atteindre leur structure native par mutation, conditions environnementales ou mauvais traitement. Il existe une deuxième branche de la famille amyloïde, présente dans tous les domaines de la vie, qui se compose de protéines qui ont évolué pour remplir des rôles biologiques dédiés (tels que l'adhésion, le stockage, l'échafaudage, etc.) en adoptant l'état amyloïde - offrant à ces protéines le terme amyloïdes fonctionnels (AF)6,7,8. Comme les amyloïdes pathologiques, les AF montrent une agrégation dépendante de la nucléation en fibres avec des caractéristiques cross-β. Une question énigmatique est de savoir si les voies de l'AF incluent des traits sélectionnés pour atténuer ou manquer le gain cytotoxique des propriétés fonctionnelles si couramment associées aux dépôts amyloïdes pathologiques. Pour les voies amyloïdes bactériennes comme curli et Fap, il est clair que les protéines accessoires assurent un dépôt amyloïde ponctuel et localisé, y compris des garanties de type chaperon qui empêchent ou arrêtent l'amyloïdogenèse prématurée9,10. Cependant, la question de savoir si les structures des sous-unités et des fibres FA incluent également des traits adaptatifs qui réduisent la cytotoxicité est beaucoup moins comprise. Fait intéressant, des expériences in vitro indiquent que les AG produits par diverses bactéries pathogènes peuvent présenter une réactivité croisée avec les AP11, et des rapports font état d'une induction ou d'une aggravation potentiellement infectieuse de dépôts amyloïdes pathologiques par ensemencement croisé direct ou effets indirects (inflammatoires) chez l'homme. et les animaux exposés aux amyloïdes bactériens12,13. Comme il n'y a que quelques structures disponibles pour les FA14,15, il n'est pas clair à ce stade si les FA sont structurellement liés aux PA et s'ils forment une branche distincte des architectures amyloïdes. On ne sait pas non plus quel pourrait être le mécanisme moléculaire de cette promiscuité amyloïde FA/PA inter-espèces.

Le pli amyloïde est signalé comme l'un des états protéiques quaternaires les plus stables. Les propriétés d'auto-assemblage préprogrammées des AG ont suscité un intérêt général pour leur utilisation dans les applications de biologie synthétique et de biotechnologie précisément en raison de leur extrême robustesse et de leur capacité à se développer spontanément avec une intervention minimale ou une assistance catalytique. Bien que certains succès aient été signalés dans le développement de matériaux fonctionnels avancés dérivés des FA16,17, il va de soi que le domaine bénéficiera d'une compréhension structurelle plus profonde pour éclairer un ensemble de principes de conception rationnels. Compte tenu des progrès récents dans la conception de protéines de novo, nous pensons que cela pourrait aider à inaugurer une ère de production de polymères amyloïdes sur mesure.

Pour aborder la tache aveugle biologique structurelle en ce qui concerne les AG, nous avons poursuivi la structure du modèle bactérien FA curli. Les fibres Curli sont un composant majeur de la matrice extracellulaire des bactéries Gram-négatives et sont exprimées dans des conditions de formation de biofilm où elles remplissent un rôle d'échafaudage et de cimentation dans le milieu extracellulaire pour renforcer la communauté bactérienne18,19. La principale sous-unité d'Escherichia coli curli est la protéine de pseudo-répétition CsgA de 13,1 kDa, qui est sécrétée sous la forme d'un monomère désordonné qui forme des fibres β croisées avec des propriétés tinctoriales amyloïdes classiques dans un large éventail de conditions20. Dans son contexte natif, la formation de fibrilles CsgA associées aux cellules nécessite la sous-unité curli mineure CsgB, qui à son tour est liée au complexe de pores de sécrétion CsgG-CsgF de la membrane externe21,22. Bien que des modèles structuraux aient été proposés pour un monomère CsgA plié basé sur la modélisation d'homologie23, la RMN à l'état solide24 et l'analyse de couplage co-évolutionnaire25, il n'y a pas de structure curli expérimentale disponible. Nous présentons ici une étude bio-informatique approfondie du noyau curli amyloïde en analysant les séquences primaires d'un catalogue CsgA local qui a été construit grâce à l'exploration exhaustive de la base de données bactérienne refseq. Sur la base de cette analyse, nous proposons différentes classes structurelles de sous-unités curli et discutons des implications attendues pour le pli CsgA et, par extension, l'architecture des fibres curli. Nous testons et validons ces prédictions sur la base d'une modélisation approfondie AlphaFold 2 (AF2) de plus de 2500 séquences homologues CsgA. Ensuite, nous avons sélectionné deux candidats CsgA pour une analyse cryoEM détaillée, à partir desquels nous dérivons des contraintes de distance et un volume cryoEM à résolution moyenne qui sont en excellent accord avec les modèles AF2 proposés. Sur cette base, nous présentons un modèle moléculaire pour une protofibrille CsgA et discutons de ses modes d'organisation d'ordre supérieur dans la matrice extracellulaire et les fibres formées in vitro.

Tout d'abord, nous avons créé une base de données locale de séquences CsgA homologues en exploitant le référentiel du génome bactérien Refseq à l'aide des profils HMM curli construits par Dueholm et al.19 Pour CsgA en particulier, nous utilisons un profil HMM spécifique à la répétition amyloïde, et est on ne s'attend donc pas à ce qu'il fasse la différence entre la sous-unité majeure de curlin CsgA et la sous-unité mineure de curlin et le prétendu nucléateur CsgB. Dans ce qui suit, nous désignerons ce groupe de protéines contenant des répétitions curli par CsgA, en gardant à l'esprit qu'une sous-population correspondra à des séquences CsgB. Une comparaison des séquences CsgA et CsgB validées est faite au dernier paragraphe de la section des résultats.

Sur un total de 201210 génomes bactériens qui ont été recherchés, 43279 (22%) génomes contenaient une ou plusieurs séquences CsgA prédites qui hébergent une ou plusieurs signatures de répétition curli (Fig. 1a). Ceci était bien corrélé avec la présence des autres gènes dans l'opéron curli. Parmi les 43279 génomes contenant CsgA, nous avons détecté CsgG, CsgF, CsgE et CsgC ou CsgH dans 41041, 41597, 41090 et 37945 ou 1839 génomes, respectivement. Seule une petite minorité (1033 ; 2 %) des génomes contenant CsgA manquaient d'une copie du canal de sécrétion curli CsgG. Ce faible nombre d'orphelins CsgA, combiné à l'excellente corrélation avec la présence d'autres protéines de biogenèse curli, démontre que l'ensemble de données résultant des séquences de protéines CsgA est principalement dérivé de gènes csgA/B intégrés dans un opéron curli. La grande majorité (40559) de ces génomes contient deux copies de type CsgA, ce qui correspond probablement à la diversification fonctionnelle en CsgA et CsgB26. Fait intéressant, des génomes peuvent être trouvés avec plus de deux homologues CsgA, le nombre de copies CsgA par génome suivant une baisse exponentielle vers 14 copies et un maximum détecté de 30 (GCF_003076275.1_ASM307627v1) (Fig. 1a). Après suppression des entrées partielles, nous obtenons une liste de 87205 séquences putatives de CsgA, qui se réduisent à un ensemble de données de 8079 séquences uniques de type CsgA de domaine mature lors de la troncature des séquences de tête et de la suppression des doublons. Comme approximation initiale du nombre de répétitions curlin par homologue CsgA, nous utilisons le nombre de résultats signalés pour la répétition curlin dans le fichier journal HMMER. Cela donne une distribution d'homologues CsgA avec des nombres de répétitions qui couvrent le spectre de 4 à 62 (WP_189563214.1), avec des maxima locaux à 5 ou 7–8 répétitions curlin (les premières typiques des entérobactéries comme Escherichia et Salmonella), et des maxima secondaires vers 15 et 22 (Fig. 1b). En traçant le nombre de répétitions prédites en fonction de la longueur de la séquence primaire, la longueur moyenne d'une répétition curlin est de 23 ± 5 (encadré Fig. 1b). Le faible écart type démontre que la longueur moyenne d'une seule répétition curlin est fortement conservée pour CsgA, et par conséquent le seront aussi les dimensions latérales des fibres résultantes (voir ci-dessous).

a Distribution du nombre d'homologues csga détectés par génome ; b Distribution du nombre de répétitions curlin prédites. Encart : nombre de répétitions curlin par longueur de protéine, avec une pente de n = 23 ± 5 aa ; c Séquence consensuelle d'une répétition curlin avec le motif curlin proposé indiqué en dessous ; d Vue sur l'axe d'un pli β-solénoïde avec des résidus conservés tournés vers l'intérieur mis en évidence ; e Séquences primaires représentatives (Seq ID entre parenthèses) de trois classes de séquences de CsgA, empilées en fonction de leurs répétitions curlin prédites, avec les motifs consensus respectifs indiqués ci-dessous (colorés en rouge et bleu pour les motifs a et B, resp., vert en cas de déviation).

La grande variation du nombre de répétitions CsgA empêche l'étude de la conservation et de la variabilité de la séquence dans le noyau amyloïde via l'alignement global des séquences. Au lieu de cela, nous avons extrait 53574 segments linéaires non chevauchants de 24aa qui sont centrés sur un motif QX10Q (et ses permutations) qui représente le noyau amyloïde prototypique des répétitions de curline CsgA. À partir de là, nous dérivons une séquence consensus27 qui présente une conservation remarquable au niveau des sites clés et montre que les répétitions curlin peuvent être divisées en motifs étroitement liés a et b, généralement séparés par une séquence à 4 résidus avec la signature XGXX, où X est n'importe quel acide aminé (Fig. 1c). Dans la structure CsgA prédite (voir ci-dessous), ces éléments de répétition curlin forment les brins 1 et 2 et la boucle de connexion ou l'arc β d'un arc β tel que défini par Henetin et al.28 En tant que tels, les résidus indiqués en rouge et bleu ci-dessous la séquence logo27 (Fig. 1c) et la représentation structurelle (Fig. 1d) correspondent aux résidus de fermeture à glissière stériques orientés vers l'intérieur, tandis que les résidus indiqués en noir (Fig. 1c) correspondent aux résidus de surface orientés vers l'extérieur du brin-arc-brin (c'est-à-dire, β-arch) motif qui constitue une seule répétition curlin. La signature de base des motifs a et b consiste en N-$-Ψ1-$-Ψ2-$-Q où Ψn sont des résidus hydrophobes (A,I,V,L,F), S ou T et pointent vers l'intérieur de l'arc β, ainsi qu'un N bien conservé au début et Q à la fin des motifs. Les résidus sur les emplacements correspondant à $ sont exposés en surface et sont principalement polaires ou chargés (T, S, D, E, Q, N, R, Y), ce qui suggère que la plupart des fibres curli peuvent être hydrophiles. Le motif b est suivi de 4 à 5 résidus, le plus souvent dans un motif XGXX-(X). Cette région de boucle forme un deuxième arc β, reliant le motif b au motif a dans la répétition curlin suivante (Fig. 1d).

Lors de l'analyse plus détaillée des sous-unités curli, nous identifions trois classes de séquences: centrosymétrique (CS), non centrosymétrique (NCS) et dégénérée (D) (Fig. 1e). La classe CS contient des séquences répétées de curline pour lesquelles les résidus faisant face au noyau dans le motif a (c'est-à-dire, N, Ψ1, Ψ2 et Q aux positions 1, 3, 5 et 7, respectivement) forment une répétition (presque) identique dans le motif b (c'est-à-dire positions 12, 14, 16 et 18), avec A0A0E3UX01 de Pontibacter korlensis pris comme exemple représentatif (Fig. 1e). Compte tenu de la structure tertiaire attendue (Fig. 1d), cela donne une fermeture éclair stérique qui est centrosymétrique dans le placement des résidus faisant face au noyau. Notamment, les résidus tournés vers l'extérieur (c'est-à-dire $) n'adhèrent pas à la pression sélective qui conserve la centrosymétrie observée dans les répétitions curlin des séquences CsgA de classe CS. Les séquences CsgA de classe NCS sont composées de répétitions curlin pour lesquelles les résidus faisant face au noyau dans les motifs a et b ne sont pas des répétitions (presque) parfaites, ce qui donne des fermetures éclair stériques non centrosymétriques, comme c'est le cas pour CsgA de E. coli ou Salmonella enterica (Fig. 1e). Dans EcCsgA, N est remplacé par S dans le motif a, et les positions Ψ1, Ψ2 sont des hydrophobes volumineux (I, L, M), contre principalement de petits hydrophobes (A, V) dans le motif b. Une troisième classe de séquences CsgA peut être discernée, montrant des répétitions dégénérées, c'est-à-dire des répétitions pour lesquelles soit le motif a et/ou b est incomplet (par exemple, l'absence du flanquement N dans le motif a ou Q dans le motif b), et/ou où les répétitions de curlin sont considérablement plus longues que la moyenne de 23 résidus en raison des insertions en aval du motif a (c'est-à-dire l'arc 1) ou du motif b (c'est-à-dire l'arc 2), avec A0A0S1S4K2 de Sediminicola sp. YIK13 comme exemple représentatif. Moins fréquemment, les insertions peuvent également tomber à l'intérieur du motif a ou b, cependant, avec A0A0T5PAS6 de Roseovarius indicus comme exemple représentatif (Fig. 1e).

Enfin, notre analyse de séquence révèle que les séquences CsgA peuvent se terminer par une répétition complète ou une demi-curline, c'est-à-dire se terminer par une séquence prototypique de motif a - arc - motif b ou par une séquence de motif a uniquement (Fig. 1e). Étant donné que les motifs a et b représentent les brins 1 et 2 des arcs β de curlin, on peut s'attendre à ce que la terminaison dans un arc β complet ou incomplet influence les contacts intersous-unités dans les fibres résultantes (voir ci-dessous). Il convient également de noter que les séquences CsgA peuvent commencer par une seule répétition curline dégénérée où les N (S) et Q flanquants des deux motifs a et b sont mutés, fréquemment en G, avec EcCsgA (Fig. 1e) comme exemple représentatif. Dans le cas d'EcCsgA, cette répétition N-terminale dégénérée est connue sous le nom de N22 et représente une séquence de ciblage qui se lie au canal de sécrétion CsgG et qui s'est avérée ne pas s'incorporer dans le noyau amyloïde de la fibre curli20,29. Il convient de noter que notre analyse de séquence indique que la présence d'une séquence de type N22 est une valeur aberrante supérieure à la règle. Dans la section suivante, nous discutons d'abord des structures tertiaires prédites pour les séquences CsgA de classe CS, NCS et D et des implications structurelles pour le monomère CsgA plié. Notez que nous nous concentrons ici sur une classification structurelle des motifs et sous-unités curlin, pour une analyse phylogénétique, nous renvoyons les lecteurs aux travaux antérieurs de Dueholm et al.19

Nous avons utilisé la mise en œuvre localcolabfold30,31,32 d'AlphaFold2 (AF2) pour prédire la structure de 2686 séquences CsgA uniques. Cela constitue un sous-ensemble représentatif de la base de données CsgA totale, englobant la gamme complète des répétitions prédites ainsi que la diversité des motifs de répétition. Nous obtenons une valeur pLDDT moyenne de 83 ± 9 pour l'ensemble de données total (voir Fig. 1 supplémentaire). Pour 741 modèles (27 %), la valeur pLDDT est supérieure à 90, tandis que 237 modèles (8 %) obtiennent un score inférieur à 70. DeepMind rapporte pLDDT > 90 comme prédictions de haute précision, entre 70 et 90 comme bonnes prédictions de base et pLDDT < 70 comme peu fiables et à traiter avec prudence31. Tous les modèles partagent une architecture β-solénoïde similaire, dans laquelle les répétitions curlin se replient en motifs brin-β-arc-brin qui s'empilent verticalement pour produire une structure de feuille β double parallèle dans le registre avec un décalage à un seul brin (c'est-à-dire 2,4 Å) entre les deux feuilles (Fig. 2, Fig. 2 supplémentaire). Cette topologie correspond à nos observations cryoEM sur les fibrilles de curlin matures, dont nous discutons en détail ci-dessous. Cela signifie également que les variations du nombre de répétitions sont en corrélation linéaire avec la dimension à axe long d'un monomère CsgA, et que le curliome s'étend sur un continuum de monomères solénoïdaux.

Représentation de bande dessinée d'exemples représentatifs (avec ID d'accession Uniprot et score AF2 pLDDT) pour chaque catégorie, avec une vue transversale ci-dessous en représentation bâton pour mettre en évidence les résidus de fermeture éclair stérique et l'alignement des répétitions le long de l'axe long. Tous les modèles partagent la même architecture de base, c'est-à-dire un assemblage hélicoïdal de motifs répétitifs brin-tour, résultant en un noyau plissé β flanqué de deux arcades β. un modèle AF2 de R15.5 de Pontibacter korlensis, caractérisé par un motif de fermeture éclair pseudo-centro-symétrique et des brins N- et C-terminaux sur la même feuille du solénoïde β ; b CsgA de E. coli avec des brins de terminaison sur les côtés opposés du solénoïde et un motif non centrosymétrique ainsi qu'une extrémité N-terminale désordonnée (1–22); c CsgA de Sediminicola sp. YIK13 avec des résidus de fermeture éclair stériques variables conduisant à des motifs de noyau dégénérés et à des insertions d'arc2 ; d CsgA de Roseovarius indicus avec des insertions de boucle et de brin de longueur variable.

En tant que structure représentative des monomères CsgA de classe CS, nous discutons du modèle AF2 de A0A0E3UX01 (pLDDT = 93, 68; Fig. 2a), qui a 15 répétitions curlin et une demi-répétition supplémentaire à l'extrémité C-terminale (ci-après dénommée R15.5 ). AF2 prédit un solénoïde β très régulier (la RMSD moyenne de la chaîne principale entre les répétitions consécutives est de 0,18 ± 0,02 Å) gaucher avec une torsion négligeable (RMSD moyenne de la chaîne principale des 5 meilleurs modèles AF2 : 0,48 ± 0,38 Å). Ainsi, le monomère est constitué d'un empilement translationnel presque pur des arcs β formés par les répétitions curlin. Une vue transversale sur l'axe permet de mieux comprendre la nature structurelle de la fermeture éclair stérique, qui comprend un noyau hydrophobe central composé des résidus Ψ1 et Ψ2 dans les motifs a et b, flanqués de chaque côté par une glutamine (Gln), suivi par une asparagine (Asn), formant le noyau pseudo-centrosymétrique prédit sur la base des caractéristiques de séquence des motifs a et b. Les groupes amide de la chaîne latérale de Gln 7 et 18 dans le noyau de curlin (la numérotation comme dans le motif consensus Fig. 1c) s'engagent dans un vaste réseau de liaisons hydrogène, formant une échelle de liaisons H avec le Gln équivalent dans les répétitions flanquantes, et avec les carbonyles de la chaîne principale des brins opposés appartenant à son parent ou à sa répétition adjacente aux positions 13 ou 2, respectivement (Fig. 3a supplémentaire). Ces interactions sont facilitées par le décalage entre les deux feuilles et constituent vraisemblablement une contribution majeure à la stabilisation du garnissage feuille sur feuille, qui correspond à une moyenne de 239 Å2 par répétition. Les résidus Ψ1 et Ψ2 dans les motifs a et b s'interdigitent dans un noyau hydrophobe, fournissant probablement une stabilisation supplémentaire de l'emballage en feuille dans le solénoïde β. Il convient de noter que notre recherche HMM a identifié des séquences de type CsgA de classe CS où Ψ1 et Ψ2 forment un noyau purement hydrophile constitué de Ser / Thr, tel que A0A249PTX6 de Sinorhizobium fredii (Fig. 3b supplémentaire). Bien que ces séquences consistent en des répétitions régulières du noyau canonique N-$-Ψ1-$-Ψ2-$-QXGXXN-$-Ψ1-$-Ψ2-$-QXGXX et qu'il soit prévu qu'elles adoptent le solénoïde curli β, elles n'ont pas font partie d'un opéron Csg.

Alors que les Glns stabilisent les interactions inter-répétitions, ainsi que le tassement des brins croisés, les résidus N1 et N12 forment un vaste réseau de liaisons H stabilisant respectivement l'arc β 2 et l'arc β 1 (Fig. 3a supplémentaire). Asn 1 est à la distance d'interaction de la liaison H du carbonyle de la chaîne principale et de l'amide des résidus G20, f dans la répétition curlin +2 et de N1 dans la répétition +1, tandis que N12 est à la distance de la liaison H de la chaîne principale de X8, G9, X10 et N12 dans la répétition +1. Malgré une faible conservation de séquence dans les positions 10–11 sur les 15 répétitions, AF2 prédit que la trace de la chaîne principale sera quasi isomorphe tout au long (RMSD moyenne de la chaîne principale de 0, 04 ± 0, 01 Å pour des positions équivalentes dans les arcs β), donnant un β ininterrompu -arcade qui est encore stabilisée par les liaisons H de la chaîne principale dans les arcs β consécutifs. Si nous normalisons tous les contacts polaires potentiels dans le noyau du solénoïde β (c'est-à-dire à l'exclusion des résidus localisés en surface) au nombre de répétitions, alors R15,5 contient 29,6 candidats de liaison H par répétition.

En tant que structure représentative des monomères CsgA de classe NCS, la prédiction AF2 pour CsgA à partir d'E. candidats par répétition (RMSD moyen de la chaîne principale des 5 meilleurs modèles AF2 : 0,20 ± 0,14 Å). Comme prévu à partir de l'analyse de séquence, l'emballage des feuilles β du motif a et du motif b (feuilles 1 et 2) perd la centrosymétrie observée dans la classe CS CsgA. Dans EcCsgA, la colonne Asn en position 1 est remplacée par une colonne Ser, brisant la nature centro-symétrique de la fermeture éclair stérique. Cette colonne de résidus de sérine peut être considérée comme un remplacement fonctionnel de N1 en ce qu'ils stabilisent également l'arc β 2, mais ont un potentiel de liaison H plus faible par rapport à l'asparagine. EcCsgA perd également la centrosymétrie dans le noyau hydrophobe, constitué de résidus Ψ1 et Ψ2 hydrophobes volumineux dans le motif a (positions 3 et 5) par rapport aux petits hydrophobes dans le motif b (14 et 16) (Fig. 2b). Cela se compare à un emballage symétrique des positions Ψ1 et Ψ2 des séquences de classe CS (Fig. 2a). Néanmoins, l'emballage feuille à feuille dans EcCsgA englobe une surface enterrée de 231 Å2 par répétition, seulement légèrement inférieure à celle observée dans R15.5. Une perte de symétrie supplémentaire se manifeste au niveau des arcs β: l'arc 1 est constitué du motif prototypique XGXX (dans EcCsgA XGXG) et a une courbure étroite, tandis que l'arc 2 a une largeur de 4 à 5aa et montre une mauvaise conservation de la séquence. La RMSD moyenne de la chaîne principale entre les répétitions consécutives est de 0,19 ± 0,01 Å, ce qui est similaire à la valeur obtenue pour R15,5. L'extrémité N-terminale d'EcCsgA contient une répétition curline imparfaite connue pour servir de signal de sécrétion et qui reste accessible à la protéase dans la fibre mature20,29. La valeur moyenne de pLDDT pour ces 22 premiers résidus (N22) est de 47, et N22 est modélisé de manière incohérente entre diverses prédictions AF2, soit désordonnées, soit partiellement ancrées sur l'échafaudage β-solénoïde. Enfin, le solénoïde EcCsgA se termine sur une répétition complète, ce qui signifie que la sous-unité se termine par un surplomb de la feuille 1 (motif a) et de la feuille 2 (motif b) aux extrémités N et C, respectivement. Dans R15.5, qui se termine par une demi-répétition, les surplombs N- et C-terminaux sont situés sur la feuille 1 (Fig. 2a).

Comme exemple d'un monomère curlin avec des répétitions dégénérées, nous nous concentrons sur A0A0S1S4K2 pour lequel AF2 prédit un solénoïde β gaucher à 10 brins avec une moyenne de 25,6 candidats de liaison H par répétition (pLDDT = 77,3 ; Fig. 2c) (moyenne RMSD de la chaîne principale des 5 meilleurs modèles AF2 : 0,62 ± 0,38 Å). La séquence A0A0S1S4K2 montre des déviations dans les colonnes N et Q du motif a et/ou b, y compris des substitutions pour les résidus hydrophobes. Ces substitutions N / Q perturbent la fermeture à glissière stérique régulière renforcée par la liaison H et se retrouvent fréquemment aux positions de flanc des saillies dans l'arc reliant les motifs respectifs. Cela se traduit par une augmentation modérée de la RMSD de la chaîne principale à travers les répétitions voisines (0,35 ± 0,07 Å). Encore une fois, ces alternances dans les résidus de noyau curlin n'affectent pas de manière significative la surface enterrée pour l'emballage des motifs a et b lors du pliage du solénoïde β, qui englobe une moyenne de 230 Å2/répétition. Un autre écart par rapport à un pli curlin canonique symétrique se poursuit pour notre quatrième exemple. Le modèle AF2 pour A0A0T5PAS6 comprend un solénoïde gaucher avec 8 répétitions, avec des insertions dans le brin 1 des répétitions 1, 2, 3 et 4 (pLDDT = 75,9 ; Fig. 2d) (RMSD moyen de la chaîne principale des 5 meilleurs modèles AF2 : 0,46 ± 0,26 Å). La RMSD nette entre les répétitions pour des positions Ca équivalentes (c'est-à-dire sans tenir compte de ces insertions) est de 0,45 ± 0,05 Å et reflète les écarts locaux par rapport à la géométrie idéale du solénoïde pour s'adapter auxdites insertions. Cependant, cela ne se traduit pas par une réduction du potentiel de liaison H total, qui est de 29,5 par répétition, ni par une surface/répétition ébavurée significativement altérée, qui englobe 220 Å2.

Une inspection minutieuse de la bibliothèque de modèles CsgA AF2 a révélé une ambiguïté dans la latéralité des β-solénoïdes prédits. Cette ambiguïté était en corrélation avec le nombre de séquences dans les alignements de séquences multiples. Lorsqu'elles sont exécutées sans MSA ou en cas de MSA peu peuplées (c'est-à-dire lors de l'utilisation du mmseq2 par défaut dans colabfold), les séquences CsgA ont été fréquemment prédites comme des solénoïdes β droitiers, alors que les mêmes séquences traversent AF2 avec des MSA bien peuplées obtenues en utilisant systématiquement jackhmmer conduire à un solénoïde β gaucher. Ceci est illustré dans la Fig. 4 supplémentaire pour R15.5. Fait intéressant, les deux prédictions ont des erreurs d'alignement prévues, des cartes de contact et des scores pLDDT globaux (droite : 92,8 ; gauche : 93,7) et pTM (droite : 0,91 ; gauche : 0,89) similaires, ce qui empêche une différenciation a piori entre les deux possibilités. L'analyse de MolProbity33 des modèles assouplis AMBER les mieux classés pour les variantes R et L a produit des statistiques structurelles similaires dans l'ensemble, avec un score de MolProbity essentiellement indiscernable (droite : 0,68 ; gauche : 0,65). La différence la plus notable entre les deux modèles - en dehors de la latéralité - était la torsion globale des deux feuilles dans le solénoïde β. Les modèles droitiers (R) ont systématiquement une torsion de ± 20 °, contrairement aux modèles gauchers (L) (Fig. 4 supplémentaire).

En l'absence de facteurs sélectifs cinétiques des voies de repliement respectives, il semble que les modèles L et R soient tous deux des états finaux théoriques plausibles. Les fibres curli sont-elles en pratique des mélanges racémiques ou y a-t-il un facteur discriminant ? Compte tenu de la torsion non nulle du modèle R, nous prévoyons qu'une protofibrille R R15,5 serait de nature hélicoïdale, avec une montée et une torsion de 7,2 nm et 20° (c'est-à-dire 4,8 Å et 1,3° par répétition) , respectivement, alors qu'un L-protofibrille serait construit à partir de la symétrie translationnelle uniquement (voir la section suivante pour des informations supplémentaires ainsi que la Fig. 4 supplémentaire). Le premier est en conflit direct avec nos données cryoEM (voir ci-dessous) car une protofibrille R hélicoïdale produirait des moyennes de classe 2D qui couvrent un continuum d'orientations de fibrilles, ce qui n'est pas observé expérimentalement, indiquant que les protofibrilles R sont très rares ou absentes de la base de données. Semblable à R15.5, AF2(mmseqs2) produit un modèle droitier pour EcCsgA avec une torsion de 11° (c'est-à-dire ~2,2° par répétition), alors que le modèle AF2(jackhmmer) gaucher montre une traduction pure du curlin répéter. Encore une fois, seule cette dernière est étayée par nos données cryoEM sur les fibres de curlin qui ont été purifiées à partir d'un biofilm bactérien (discuté en détail ci-dessous). Ceci est également en accord avec l'imagerie AFM haute résolution, qui n'a pas discerné de torsion hélicoïdale dans les fibres EcCsgA individuelles34. Ainsi, au moins pour P. korlensis et E. coli CsgA, les fibres curli in vitro et ex vivo se sont avérées (principalement) constituées de sous-unités comprenant un solénoïde β gaucher. Bien que cela n'ait pas été observé jusqu'à présent, il ne peut être exclu que différents homologues de CsgA ou différentes conditions environnementales favorisent un droitier.

Après avoir établi les caractéristiques structurelles d'un monomère curlin, nous portons notre attention sur les prédictions d'assemblages homo et hétéromères. Les monomères Curlin se terminent par deux feuillets β à bord ouvert avec un décalage de 2,4 Å, c'est-à-dire résultant en un seul brin en surplomb à chaque extrémité. Ainsi, les sous-unités présentent un surplomb du motif a (feuille 1) à l'extrémité N-terminale, et un surplomb du motif b (feuille 2) ou du motif a (feuille 1) à l'extrémité C-terminale pour les séquences se terminant par une répétition curlin complète ou demi, respectivement (Fig. 3a). Si l'interface d'emballage entre deux monomères peut être prédite avec une confiance raisonnable, alors un modèle pour l'architecture curli peut être déduit. Pour ce faire, nous avons d'abord évalué les capacités d'AF2 pour prédire et reproduire avec précision les caractéristiques spécifiques des assemblages de protéines fibreuses, telles que la présence d'un axe de vis et la polarité des fibres. Pour cela, nous avons effectué des prédictions AF2 des filaments de bactofiline de Thermus thermophilus qui sont composés de domaines β-hélicoïdaux associés bout à bout (déposé le 2019-04-23, AF2 training set 2018-04-30). Nous utilisons la structure de filament cryoEM 6RIB comme référence et la comparons à un modèle trimère (pLDDT = 86, 2; pTMscore = 0, 75) qui a été prédit à l'aide du multimère AF2 (Fig. 5 supplémentaire). Dans l'ensemble, il existe un excellent accord entre la structure prédite et expérimentale, avec une RMSD tous atomes de 1,53 Å (2298 atomes). AF2 prédit avec précision la nature apolaire des filaments (c. nature (c.-à-d., présence d'un axe de vis). Cela a renforcé notre confiance dans la méthodologie AF2 proposée pour la modélisation de curlin et nous a incités à examiner plus en détail un trimère AF2 CsgA.

a Représentation schématique des blocs de construction monomères pour les séquences CsgA se terminant par une répétition complète ou une demi-répétition, créant un motif C-terminal b ou un motif a en surplomb, respectivement. L'empilement tête-bêche ou queue-queue/tête-tête des monomères CsgA donnera une fibre avec un empilement croisé des monomères des arcades β. L'empilement tête-bêche entraîne une arcade β parallèle dans toute la fibre, la direction tête-tête / queue-queue alterne les brins β, créant une interface antiparallèle. Un empilement tête-bêche de séquences CsgA avec queue à demi-répétition implique un axe à 21 vis pour une liaison H productive de l'arcade β aux interfaces des sous-unités. b, c Les assemblages CsgA multimériques représentent des protofibrilles minimalistes : b Trimère EcCsgA tel que prédit par AF2 dans lequel les monomères s'empilent "tête-bêche" via une interface R5/R1 unique résultant en une protofibrille polaire (uniquement symétrie translationnelle) avec une extrémité R1 et R5 . Représentation en bâton de l'interface R5/R1 avec des liaisons hydrogène inter-chaînes putatives représentées en pointillés ; Pour le protomère CsgA central, le motif a et le motif b sont colorés en rouge et bleu, resp. c Dimère R15.5 tel que prédit par AF2 dans lequel deux monomères s'empilent "tête-bêche" et effectuent une rotation de 180° l'un par rapport à l'autre. Le protofibrille a un type unique d'interface intermoléculaire (R15.5/R1), avec une symétrie translationnelle de 21 et des extrémités polaires formées par les répétitions R1 et R15.5, respectivement.

Le modèle AF2 d'un trimère EcCsgA se compose de trois monomères empilés tête-bêche qui interagissent via leurs répétitions R5 / R1 au moyen d'une augmentation de feuille β, formant un pli solénoïde continu (Fig. 3b, Fig. 6 supplémentaire). Cet assemblage de proto-fibrilles est construit à partir d'une symétrie translationnelle pure, sans axe de vis présent ni torsion mesurable. En regardant l'interface entre deux monomères, nous trouvons une transition presque transparente du réseau de liaisons hydrogène du solénoïde β, c'est-à-dire que l'interface R5 / R1 contient 23,3 liaisons H putatives (moyenne sur le trimère) qui est à égalité avec le nombre moyen de candidats de liaison H entre les répétitions au sein d'un seul monomère CsgA. Cette continuité est facilitée par les faibles valeurs de RMSD entre R1 et R5, ainsi que la conservation des résidus zipper stériques conduisant à une digitation inter-moléculaire très similaire aux contacts intra-moléculaires. Le motifA-arc1-motifB-arc2 β-arcade continue sans interruption. AF2 prédit que N22 est désordonné et exclu de l'arcade curli β, et dépasse donc des fibres, conformément à sa sensibilité protéolytique rapportée dans les fibres curli matures20.

Il convient de souligner que, bien que non prédit par AF2, CsgA pourrait également être capable de s'oligomériser par des interactions consécutives queue-à-queue / tête-à-tête (Fig. 3a, Fig. 6 supplémentaire). À cette fin, nous avons manuellement mis deux molécules CsgA en contact R5/R5, et effectué un docking local à l'aide de RosettaDock pour optimiser la géométrie locale (score d'interface : -9,5). Nous faisons référence à ce dimère queue-à-queue à un dimère CsgA tête-à-queue optimisé de la même manière où nous avons utilisé le modèle AF2 comme entrée de RosettaDock (score d'interface : -15, 5). Les deux modèles ont un nombre similaire de liaisons H putatives à l'interface dimère (23 contre 21), mais le modèle queue-à-queue est anti-parallèle, déclenchant un décalage latéral de 1 résidu entre les deux brins à l'interface, et une mauvaise contacts dans les fermetures à glissière stériques N / Q aux arcades en conséquence. L'extrapolation d'un tel dimère à une protofibrille produit un motif décalé avec une fréquence de 2 nm, que nous n'observons pas expérimentalement (voir Fig. 4c), réaffirmant le modèle tête-bêche produit par AF2. De plus, nous avons précédemment trouvé que les fibres EcCsgA présentaient une cinétique d'extension polaire, une observation qui n'est compatible qu'avec une interaction tête-bêche des sous-unités curli34.

une image cryoEM à faible grossissement (25k) de la matrice extracellulaire de MC4100 résolvant deux types de fibres : flèche blanche, filaments curli ; flèche noire, fibres non identifiées, potentiellement eDNA ou polysaccharide ; b Image CryoEM à 60k de fibres curli isolées ; c vue latérale RELION 4.0 Classe moyenne 2D des protofibrilles curli ; d Image CryoEM à 60k de fibres R15.5 recombinantes formées in vitro dans 15 mM MES 6.0 ; e, f RELION 4.0 vue de dessus et vue latérale 2D moyennes de R15,5 ; g, h Vue de dessus, de côté (g ; représentée en coupe transversale), inclinée et sur l'axe h d'un volume cryoEM RELION 4.0 Class3D d'une fibrille R15.5 illustrée au niveau 0,0137 ; Amarrage d'une unité trimérique du modèle R15.5 AF2 dans le volume cryoEM, avec des monomères alternativement colorés en orange et cyan. Toutes les images cryoEM sont représentatives des grilles de> 10 préparations d'échantillons indépendants.

Pour R15.5, le mécanisme tête-bêche de la dimérisation semble similaire en première instance, c'est-à-dire l'augmentation du solénoïde β via l'amarrage des feuilles ouvertes et la complémentarité de la fermeture éclair stérique (Fig. 3c; Fig. Supplémentaire 7). Cependant, R15.5 a un nombre impair de brins (c'est-à-dire 31), ce qui donne un motif en surplomb à la fois aux extrémités N et C-terminales. Cette géométrie ne permet pas une simple interaction translationnelle tête-bêche (Fig. 3a). Au contraire, une bonne correspondance de deux motifs a en surplomb sur une interface dimère nécessiterait une fibre constituée d'interactions tête-tête-queue-queue consécutives (Fig. 3a) ou d'interactions tête-à-queue avec une double vis, c'est-à-dire 180 ° rotation des sous-unités consécutives le long de l'axe longitudinal de la fibre (Fig. 3a). Lors de l'évaluation de la dynamique de croissance d'une seule fibre pour l'assemblage in vitro de R15.5 par imagerie AFM, nous avons constaté que les fibres affichaient un pôle d'extension lent (c'est-à-dire 0,8 ± 0,1 nm / s) et rapide (4,5 ± 0,1 nm / s) (Fig. 8), indiquant que les fibres sont polaires et adoptent donc probablement une interaction tête-bêche. La formation de disulfure de résidus Cys introduits à travers l'interface R15.5 s'est produite conformément à un axe de vis 21 (Fig. 8a, b supplémentaire), et la prédiction de novo par AF2 a également montré une vis 21 tête-bêche dans la sous-unité-sous-unité interface (Fig. 3c et Fig. 7 supplémentaire). Enfin, la comparaison de modèles in silico de dimères tête-bêche et queue-queue obtenus avec RosettaDock35 a montré qu'une transition transparente de l'arcade β entre deux molécules ne se produit que dans la première, facilitée par la nature centro-symétrique du stérique fermeture éclair dans ce monomère de classe CS. Pour cette interface R15.5 vis-axe, 32 liaisons H putatives sont trouvées (au lieu de seulement 12 pour les interactions queue-queue, Fig. 7 supplémentaire), ce qui est remarquablement cohérent avec la moyenne de 29,6 entre les répétitions dans un R15.5 monomère. Nous notons également que le deuxième arc β est réduit de 4aa à 3aa dans les deux dernières répétitions. Ceci à son tour s'adapte parfaitement à la continuation de la β-arcade 2 du premier monomère dans la β-arcade 1 du deuxième monomère à travers l'interface.

Enfin, compte tenu de la conservation élevée de la séquence et de la structure dans le noyau amyloïde CsgA, nous avons étudié les contacts hétéromères entre les homologues CsgA de différentes espèces. Ceci est pertinent car il a été démontré qu'un ensemencement croisé promiscuité se produit entre les curli produits dans les biofilms interspécifiques36. Pour cela, nous avons examiné un modèle AF2 d'un dimère CsgA-CsgA Citrobacter-Salmonella (pLDDT : 79,8 ; pTMscore : 0,78 ; Fig. 9 supplémentaire). Ce dimère est conceptuellement identique à l'homotrimère illustré à la Fig. 3a en ce que la répétition R5 de CsgA_Citrobacter s'arrime à la répétition R1 de CsgA_Salmonella, sans axe de vis présent. Ces résultats montrent que l'architecture de répétition conservée facilite l'amarrage de monomères disparates dans les fibrilles, facilitant ainsi la réactivité croisée inter-espèces de curlin.

Dans leur contexte naturel, les fibres curli sont produites sous la forme d'une masse erratique et enchevêtrée qui constitue le composant majeur de la matrice extracellulaire (ECM) dans des conditions de formation de biofilm18. Ceci est illustré par l'image cryoEM à faible grossissement (1, 88 Å / pixel; 20k; Fig. 4a) que nous avons collectée de l'ECM produit par E. coli MC4100 après 72 h de croissance sur gélose YESCA à température ambiante. Dans la Fig4a, plusieurs structures filamenteuses peuvent être discernées émanant d'une cellule bactérienne et engloutissant. Les tentatives de génération de moyennes de classe cryoEM stables à partir de segments de filaments extraits numériquement ont échoué. Nous avons donc procédé à l'isolement des fibres de curli ex vivo en suivant le protocole d'extraction optimisé par Chapman et al. conglomérats de curli conduisant à un échantillon de curli dispersé à partir duquel un ensemble de données cryoEM a été collecté à un grossissement de 60k (0, 784 Å / pixel; Fig. 4b). Bien que la plupart des curli existaient encore sous forme de gros faisceaux multifilamenteux, des fragments de fibre unique permettaient une moyenne 2D à l'aide de RELION 4.038, produisant une moyenne de classe de vue latérale unique avec des caractéristiques de structure secondaire présentes (Fig. 4c). Cela a révélé une architecture bêta croisée caractérisée par une répétition de 4, 8 Å, une largeur de fibrille de 20 Å et un décalage d'une demi-unité entre les brins β opposés dans les deux feuilles du solénoïde β. Le spectre de puissance correspondant présente deux maxima larges à 1/4,8 Å−1 et 1/10 Å−1 dans un angle de ~ 13° et 90° par rapport au méridien, reflétant respectivement l'espacement décalé de 4,8 Å des brins β et le Espacement d'environ 10 Å des deux feuillets β (Fig. 10 supplémentaire). Ces chiffres correspondent étroitement aux architectures de monomères et de fibres d'EcCsgA prédites par AF2. L'absence d'autres maxima dans le spectre de puissance suggère une absence de symétrie hélicoïdale, bien qu'une faible symétrie hélicoïdale sous la forme d'un axe de vis double ne puisse pas être déterminée sur la base de ces seules données. Cependant, notre analyse de la structure trimérique AF2 suggère que la présence d'un axe de vis est peu probable, ainsi que les modèles de marquage nanogold obtenus par Chen et al. sont en accord avec une propagation tête-bêche purement translationnelle des sous-unités CsgA dans les fibres curli17.

Nous notons également qu'il n'y a pas de caractéristiques claires qui délimitent l'interface entre deux monomères CsgA successifs (cfr. un seul monomère se compose de 5 motifs bêta-arc-bêta), ni de maxima à basse résolution dans le spectre de puissance à partir duquel un la période de la fibre pourrait être estimée (Fig. 10a supplémentaire). Cela signifie que l'alignement latéral des segments curli dans le protocole de classification n'a pas trouvé de registre de fibrilles, conséquence probable de la transition quasi transparente entre les monomères successifs et de la nature quasi isomorphe des répétitions. Par conséquent, en raison du manque de moyennes de classe haute résolution supplémentaires correspondant à différentes orientations de fibrilles, la reconstruction 3D n'était pas réalisable à ce stade. Les tentatives pour obtenir d'autres classes 2D à l'aide de fibres EcCsgA cultivées in vitro34 ont échoué en raison de la forte tendance au regroupement des fibres.

À la lumière des problèmes d'instabilité colloïdale d'EcCsgA, nous avons décidé de poursuivre la structure d'un homologue CsgA. Pour cela, nous avons sélectionné R15.5 en raison de sa teneur élevée en Asp et Glu (20 % ; pI = 2,98), ce qui nous amène à émettre l'hypothèse que les protofibrilles R15.5 seraient moins susceptibles de s'emmêler en raison de l'électrostatique répulsive. R15.5 a été exprimé par recombinaison et purifié à partir des corps d'inclusion et laissé polymériser après échange de tampon. L'analyse TEM a révélé des fibres de type curli qui ne présentaient qu'une agrégation inter-fibrillaire minimale (Fig. 4d). Compte tenu de sa teneur élevée en Asp et Glu, présente dans les échelles stériques sur la surface du motif R15.5 a (feuille 1), nous avons testé si la formation de fibrilles R15.5 pouvait être réglée en modifiant le pH ou en utilisant Ca2+ comme contre-ion pour éviter la répulsion de charge . De manière quelque peu inattendue, R15.5 a encore formé des fibrilles en présence d'EDTA 10 mM, de MES 6.0 15 mM (Fig. 11 supplémentaire) ou de bicine 50 mM pH 9.0 (Fig. 11 supplémentaire), conditions où la formation des échelles Asp ou Glu lors du repliement et de la polymérisation de R15.5, on s'attendait à ce qu'ils entraînent une répulsion de charge. Cependant, lorsque nous complétons 15 mM MES 6.0 avec 10 mM CaCl2 (Fig. 11 supplémentaire) ou changeons le tampon en acétate de Na 50 mM 4.0 (Fig. 11 supplémentaire), nous observons une augmentation marquée des agrégats fibrillaires. Remarquablement, il n'a pas été constaté que le pH avait un effet significatif sur la cinétique de polymérisation de R15.5 (Fig. 12 supplémentaire), à ​​en juger par la décroissance temporelle des spectres RMN 1D H (R15.5 montre une mauvaise liaison au ThT) qui ont été collectés au cours du processus. du processus de fibrillation. Ces résultats démontrent que l'amyloïdogénicité de R15.5 est robuste, mais que l'électrostatique du solvant peut dans une certaine mesure régler les propensions à l'agrégation des fibres.

Sur la figure 4d, nous montrons une image cryoEM représentative de fibrilles R15.5 cultivées in vitro et les moyennes de classe RELION 4.0 2D correspondantes, que nous attribuons comme vues de face et de côté. La vue latérale R15.5 est presque identique à la vue latérale de E. coli curli, ce qui suggère que les curli ex vivo et les fibrilles R15.5 in vitro sont structurellement équivalentes au niveau du pli et essentiellement en accord avec les prédictions AF2. Des moyennes de classe 2D supplémentaires correspondant à différentes vues tournées le long de l'axe des fibrilles sont présentées dans la Fig. 13b). Refine3D dans RELION 4.0 à l'aide d'une reconstruction hélicoïdale avec des valeurs de torsion et d'élévation fixes correspondant à 180° et 72 Å (symétrie : C1 ; valeur T : 25) à l'aide d'un volume Class3D de premier ordre provenant d'une tâche précédente et des particules correspondantes en entrée, a donné un volume de résolution de 7,6 Å (FSC 0,143; tableau S1) qui est en accord avec les caractéristiques structurelles des modèles prédits pour CsgA, à savoir les dimensions globales des fibrilles, l'architecture cross-β, le décalage entre les brins opposés dans les répétitions curli, et les distances inter-répétitions caractéristiques de 4,8 Å. L'amarrage d'un modèle R15.5 AF2 (Fig. 4h) montre un bon accord entre le volume cryoEM expérimental et l'architecture β-solénoïdale prédite. Le caractère presque isomorphe et centrosymétrique des répétitions curlin se traduit par un manque de caractéristiques à basse résolution pour guider les premières étapes de l'alignement des particules 3D. Stratégies pour introduire des repères exposés en surface (par exemple, marquage His-tag à l'aide de particules de nano-or Ni-NTA de 5 nm de diamètre ; insertion de domaines repliés dans l'arc-1 ou l'arc-2 de la répétition 8 ; immuno-coloration avec des anticorps monoclonaux de souris anti-his ) n'a pas entraîné d'amélioration de l'alignement des particules 2D et/ou 3D. Le volume Refine3D rapporté représente donc une carte qui est moyennée longitudinalement sur les répétitions curlin (Fig. 4g).

Nos résultats montrent que la protofibrille curli est constituée d'un solénoïde β supermoléculaire très régulier avec une torsion hélicoïdale absente ou négligeable. Fait intéressant, en plus de produire des protofilaments simples, les fibrilles curli ont également tendance à former des structures irrégulières ou même systématiques d'ordre supérieur (Fig. 5). Les curli EcCsgA, par exemple, présentent fréquemment une association latérale en faisceaux plus épais, avec un diamètre moyen de 17 ± 9 nm (moyenne, écart type, n = 108) et des valeurs aberrantes jusqu'à 48 nm (Fig. 5g). R15.5 a montré une gamme d'associations latérales, allant de fibrilles simples (voir ci-dessus) à des dimères de fibrilles réguliers, à des réseaux plans dans lesquels plusieurs fibrilles sont empilées côte à côte de manière organisée (Fig. 5a). La moyenne de classe 2D des segments en boîte de ces feuilles de fibres résout plusieurs fibrilles R15.5 parallèles (Fig. 5b). Pour les 3 fibrilles dans la région centrale de la feuille de fibres, nous résolvons clairement les caractéristiques du solénoïde β. Les brins de chaque fibrille sont alignés avec les brins de la fibrille voisine ce qui suggère fortement qu'ils établissent des contacts inter-fibrilles spécifiques. Si l'emballage inter-fibrilles n'était pas spécifique, on pourrait s'attendre à ce que les fibrilles glissent les unes sur les autres, ce qui donnerait une moyenne de classe 2D dans laquelle une seule fibrille a ses caractéristiques de structure secondaire résolues. Une telle situation est observée pour les dimères de fibres EcCsgA, où une fibrille est résolue au niveau de la structure secondaire, tandis que les fibrilles partenaires présentent une projection étalée dans les moyennes de classe 2D (Fig. 5h). Pour R15.5, nous émettons l'hypothèse que les contacts d'emballage entre les fibrilles de R15.5 sont médiés par électrostatique. Plus précisément, le modèle AF2 de R15.5 prédit une grille carrée de résidus de glutamate et d'aspartate sur le motif exposé au solvant d'un flanc, formant un grand patch chargé négativement (Fig. 5c). En raison de l'axe de la vis pour une fibrille R15.5, ce patch négatif alternera les côtés le long de l'axe de la fibrille, facilitant ainsi la formation de ponts salins entre les fibrilles voisines médiées par des cations divalents de chaque côté de la fibrille (Fig. 5d ). Si nous complétons la solution tampon avec un excès stoechiométrique d'ions Ca2+ -30mM CaCl2 final ajouté à 3 µM R15.5- en présence de 15 mM MES pH 6.0 et 250 µM phosphate de potassium, alors nous n'observons plus la formation de feuillets, mais plutôt incrustation de fibrilles R15.5 simples (Fig. 5e). TEM résout une fibrille R15.5 de 2, 5 nm de diamètre au cœur, enveloppée par une croûte épaisse allant de 10 à 30 nm (Fig. 5f). Nous émettons l'hypothèse que cette croûte est un dépôt inorganique composé d'une phase cristalline de phosphate de calcium qui a nucléé sur la grille D/E (Fig. 5c).

une image CryoEM de fibres R15.5 parallèles empilées latéralement organisées en un réseau planaire ; b Moyenne de classe 2D des segments en boîte de la région centrale des matrices R15.5 dans laquelle la structure secondaire des trois fibrilles centrales est résolue ; c Réseau régulier de résidus d'asp et de glu exposés en surface sur le flanc de la feuille 1 du monomère R15.5 ; d Modèle idéalisé pour l'organisation supramoléculaire des fibrilles R15.5 médiées par des ponts salins inter-fibrilles. L'axe de la vis facilite l'alternance des interfaces de liaison entre fibrilles consécutives ; e Incrustation de fibrilles R15.5 en présence de CaCl2 30 mM et de traces (±250 µM) de KH2PO4/K2HPO4 ; f Zoom sur la zone encadrée en e résolvant le noyau de fibrilles (flèches jaunes) entouré d'un dépôt épais ; g Graphique en violon du diamètre des fibres de curli ex vivo purifiées à partir de l'ECM de MC4100 : ligne pleine = médiane, lignes pointillées = quartiles (n = 108 fibres) ; h Moyenne de classe 2D des fibres curli dans lesquelles une seule fibrille avec des éléments secondaires résolus. L'imagerie CryoEM de l'organisation curli et de l'incrustation est représentative des grilles de> 5 préparations d'échantillons indépendants.

La plupart des groupes de gènes curli codent pour deux protéines de type CsgA19. Chez les entérobactéries telles que Escherichia et Salmonella, où l'opéron curli est le mieux étudié, ces séquences de type CsgA se différencient en une sous-unité curli majeure CsgA, qui forme le principal composant d'auto-assemblage des fibres curli, et une sous-unité mineure CsgB, qui agit en tant que nucléateur de l'amyloïdogenèse CsgA à la fois in vitro et in vivo21,22,39. À la surface cellulaire, CsgB interagit avec le facteur accessoire extracellulaire CsgF, une interaction essentielle à la nucléation des fibres curli associées aux cellules. En l'absence de CsgB ou CsgF, les sous-unités CsgA sécrétées sont libérées dans l'environnement extracellulaire sous forme de monomères dépliés20. Pour obtenir une vue sur la séquence et les propriétés structurelles de CsgB, nous avons récupéré toutes les séquences uniques de la base de données RefSeq qui ont été annotées comme CsgB ou curlin mineur (n = 2296), supprimé leur séquence signal via Signalp640, filtré la redondance de l'ensemble de données jusqu'à < 90 % de similarité de séquence par paires et suppression de toutes les entrées partielles. Les séquences de domaine matures résultantes variaient en longueur de 50 à 561 résidus (Fig. 14a supplémentaire). Pour faciliter l'alignement global et la génération de MSA, nous avons limité notre analyse aux variants CsgB qui ont un nombre similaire de répétitions curlin (c'est-à-dire 5 répétitions, ce qui traduit des longueurs de séquence entre 100 et 160 acides aminés pour permettre des longueurs variables de la région N22 au N-terminal). La MSA organisée résultante de n = 166 séquences CsgB a donné le logo consensus suivant (voir Fig. 14c supplémentaire). À partir de là, il devient clair que la région centrale du logo consensus présente des motifs de séquence conservés qui sont similaires au noyau amyloïde curlin défini pour CsgA, c'est-à-dire N-$-Y1-$-Y2-$-Q. CsgB a été proposé d'adopter un pli β-solénoïdal qui est structurellement équivalent et donc compatible avec l'architecture d'une fibrille curli CsgA39. La prédiction AlphaFold2 de E. coli CsgB révèle un solénoïde β gauche très similaire à EcCsgA (Cα RMSD 0, 88 Å, voir Fig. 14b supplémentaire). Le motif a dans R1 et les deux motifs a et b de la répétition C-terminale (R5) sont moins conservés et dégénèrent des motifs canoniques à la position de leur premier Asn. Souvent, ces positions contiennent des résidus plus volumineux, comme Q, K et M dans E. coli CsgB (EcCsgB), qui dépassent latéralement de l'empilement autrement quasi homotypique des répétitions curlin, en particulier à R5. Cette répétition curlin imparfaite au bord C-terminal du monomère CsgB peut sous-tendre la propension réduite à l'assemblage des fibres de cette sous-unité mineure de pili. Des études antérieures ont également mis en évidence le rôle de R5 dans l'interaction CsgF-CsgB.

Notre compréhension structurelle des fibres amyloïdes a considérablement progressé au cours de la dernière décennie. Un dénominateur commun qui a émergé du vaste pool de structures amyloïdes expérimentales est le pli serpentin, c'est-à-dire un arrangement planaire de brins bêta et de tours qui forment des ultra-structures super plissées qui sont stabilisées par des interactions de fermeture éclair stériques et un empilement homotypique brin-brin . De manière frappante, les fibres amyloïdes peuvent présenter un degré élevé de polymorphisme au niveau du pli serpentin et/ou au niveau des contacts de protofibrilles2,3,4. De petits changements dans la séquence primaire ou dans les conditions de polymérisation peuvent entraîner des changements drastiques dans l'ultrastructure finale de la fibre amyloïde. Cette sensibilité de la structure quaternaire aux conditions initiales peut probablement être attribuée au fait que pour la plupart des peptides/protéines rapportés, il n'y a pas eu (ou peut-être même une pression évolutive négative) pour se replier dans une structure amyloïde spécifique. Au contraire, la plupart des amyloïdes caractérisés sont formés comme une conséquence involontaire d'un déclencheur environnemental conduisant à un processus d'amyloïdogenèse qui est stochastique et sensible aux perturbations externes.

Cela contraste fortement avec les amyloïdes fonctionnels qui ont été formés par des processus évolutifs, où les espèces hors voie et le polymorphisme incontrôlable peuvent bien être biologiquement intolérables et donc soumis à une sélection négative. Cela semble en effet être le cas pour curli. Après plus de deux décennies de recherche sur les curli, il n'y a pas d'observations expérimentales du polymorphisme des fibres, c'est-à-dire qu'il y a eu des rapports cohérents sur les diamètres des protofibrilles et aucune symétrie hélicoïdale mesurable ni modification de celle-ci. De même, nous ne trouvons aucune preuve de moyennes de classes de fibres même peu peuplées correspondant à des protofibrilles hélicoïdales. Pour curli, la cohérence structurelle est probablement une nécessité imposée par le mécanisme d'attache au complexe extracellulaire CsgG – CsgF – CsgB. Dans un processus de fibrillation dépendant de la nucléation, des conformères structurels pourraient être imposés par le complexe CsgG – CsgF – CsgB. Nous trouvons que les protofibrilles de curli isolés ex vivo et formés in vitro comprennent une structure β-solénoïde identique, ce qui suggère fortement que cette structure est une propriété intrinsèque de la séquence CsgA. De plus, la structure prédite pour la sous-unité CsgB est très similaire à celle de CsgA, assurant un modèle structurellement correspondant pour le pliage et l'assemblage de CsgA. Pour curli, la cohérence structurelle existe sous la forme d'un pli β-solénoïde conservé des blocs de construction monomères. Malgré de subtiles variations dans l'échafaudage β-solénoïde et ses décorations locales sous la forme d'insertions, les prédictions AF2 sont remarquablement conservatrices malgré de grandes variations dans la séquence primaire. On retrouve un pLDDT AF2 moyen de 83, avec environ 8% de séquences avec un score pLDDT inférieur <70. De faibles scores locaux de pLDDT peuvent indiquer un trouble local41. Dans curli, l'emballage serré des répétitions de curlin dans la structure du solénoïde β permet peu ou pas de désordre local, mais les sous-unités de curlin se trouvent dans un état intrinsèquement désordonné avant l'incorporation dans la fibre de curlin et doivent rester dépliées pour permettre le transport à travers le canal CsgG20,42. Il est intéressant de supposer que le score pLDDT inférieur pour les sous-unités curli peut refléter le caractère intrinsèquement désordonné de l'état pré-amyloïde.

Les solénoïdes β à extrémité ouverte dépourvus de domaines de coiffage43,44 donnent lieu à un mécanisme de polymérisation qui repose principalement sur la compatibilité des motifs de structure secondaire, c'est-à-dire l'augmentation de la feuille β et l'extension de l'arcade β qui est médiée principalement par les contacts de la chaîne principale, dépendante seulement dans une moindre mesure sur les contacts locaux de sidechain entre les chaînes. À cet égard, il est intéressant de noter que le pli β-solénoïde n'est pas exclusif aux curli, mais se trouve également couramment dans les protéines non fibreuses. Les recherches de similarité structurelle de la banque de données sur les protéines (http://www.wwpdb.org/) et de la base de données sur la structure des protéines Alphafold (https://alphafold.ebi.ac.uk/) révèlent des centaines de séquences non homologues (identité de séquence par paire < 10%) structures contenant des domaines β-solénoïdes avec des scores Z élevés au pli curlin (> 6 et plus; Tableau S2, Fig. 15 supplémentaire)45. Les structures connues, y compris les domaines β-solénoïdes, comprennent, entre autres, les protéines antigel et de liaison à la glace, les pointes de queue de phage, les adhésines, les protéines répétées riches en Leu, les glycosidases, les protéines de la couche S (tableau S2; Fig. 15, a supplémentaire). Notre recherche n'a identifié aucune protéine polymérisante ou de type amyloïde. Au lieu de cela, les domaines β-solénoïdes forment un échafaudage structurel pour les monomères protéiques, plutôt qu'une unité de polymérisation. Dans ces protéines β-solénoïdes, des imperfections structurelles dans le ou les motifs solénoïdes terminaux ou des ajouts de domaines stériquement bloquants empêchent la polymérisation par des interactions tête-à-queue ou queue-queue / tête-tête des monomères. Notamment, une similitude structurelle par rapport à la base de données de structure de la protéine Alphafold humaine identifie plusieurs protéines présentant des domaines β-solénoïdes à bords ouverts (tableau supplémentaire 2; Fig. 15b supplémentaire), y compris des protéines de la matrice extracellulaire telles que les mucines et les protéines associées à la kératine, ou suprabasin et non caractérisé protéine FLJ40521. Il n'est pas clair, cependant, si ces domaines β-solénoïdes supportent la polymérisation dans ces protéines. Dans curli, la préservation structurelle et la complémentarité dans l'ensemble du β-solénoïde sont garanties par un degré élevé de conservation d'un nombre limité de résidus clés qui participent aux contacts stériques de la fermeture éclair et à la stabilisation des structures β-arcade. À cet égard, nous notons que Zhou et ses collègues ont montré qu'un ensemencement croisé promiscuité peut se produire entre les curli produits dans des biofilms interspécifiques - un processus qui dépend probablement d'une architecture curli conservée36. En outre, les composants de la matrice extracellulaire tels que les curli ont été proposés comme un bien public sécrété, au moins dans les biofilms d'une seule espèce46. La conservation structurelle dans les sous-unités curli peut permettre la formation de fibres mixtes et ainsi permettre la contribution multi-espèces des monomères curli à la matrice du biofilm. Il est intéressant de supposer que les polymorphismes solénoïdes trouvés dans les familles de curlin conformationnelles définies dans ce travail, c'est-à-dire CS, NCS et D, peuvent entraîner une certaine spécificité d'ensemencement croisé de curlin et éventuellement des associations de biofilms multi-espèces. Ces dernières années, une attention croissante a également été accordée à l'activité potentielle d'ensemencement croisé des curli libérés par les protéobactéries commensales et pathogènes envers les amyloïdes pathologiques humains, avec de nombreux rapports indiquant une activité d'ensemencement ou de stimulation in vitro et in vivo envers l'amyloïdogénicité de l'α-synucléine12,47 ,48. À cet égard, il est intéressant de noter que notre similitude structurelle de la base de données de structure de la protéine Alphafold humaine identifie plusieurs protéines avec des domaines β-solénoïdes à bords ouverts avec une similitude structurelle élevée avec le pli curlin (tableau supplémentaire 2; Fig. 15b supplémentaire), y compris les protéines extracellulaires et muqueuses telles que les protéines associées à la kératine et les mucines. Cela peut justifier une attention accrue à une interaction potentielle des protéines de la matrice muqueuse et des commensaux et pathogènes producteurs de curli dans les voies intestinales et urinaires.

Les fibres Curli se taillent une place unique dans la superfamille des protéines amyloïdes. Les fibres Curli ne présentent pas le pli serpentin généralement observé pour les amyloïdes pathologiques ou récemment observé dans les amyloïdes fonctionnels à base de peptides tels que les antimicrobiens amphibiens de type LARK14. Les amyloïdes pathologiques résultent de l'empilement homotypique de fragments ou de régions peptidiques après libération ou dépliement protéolytique d'un polypeptide qui adopte habituellement un état natif globulaire. Les sous-unités Curli adoptent un état natif globulaire de solénoïde β, où la conservation élevée des résidus de noyau dans le motif de répétition curlin entraîne un empilement quasi homotypique des brins β. CsgA marie ainsi les caractéristiques des protéines globulaires avec des caractéristiques souvent associées aux amyloïdes telles qu'une structure bêta croisée empilée et une polymérisation dépendante de la nucléation. D'une part, l'état pré-amyloïde des sous-unités curli n'est pas associé à la formation d'agrégats amorphes ou d'espèces oligomères fréquemment observées dans les amyloïdes pathologiques. Au lieu de cela, les graines de curli se forment au cours d'une phase initiale stochastique de nucléation, suivie instantanément d'une étape d'extension par étapes et auto-catalysée de fibres β croisées extrêmement robustes34. D'un autre côté, cependant, l'analyse MSA révèle de forts couplages co-évolutifs qui fournissent des contraintes de distance qui prédisent de manière presque déterministe un état unique, plié et monomérique. À cet égard, la formation de curli peut également être considérée comme un processus de polymérisation classique avec la complexité supplémentaire que le taux de repliement est probablement proportionnel au taux d'agrégation, et que le repliement est modélisé une fois que la nucléation primaire a eu lieu. Dans ce modèle, le porte-à-faux à brin unique aux extrémités de la fibre fournirait une surface de modèle qui recrute et aide à replier les protomères CsgA entrants. Au moins in vitro, les fibres EcCsgA curli s'étendent des deux extrémités des fibres, bien qu'avec des cinétiques nettement différentes34. Des études futures seront nécessaires pour déterminer le fondement structurel de ces cinétiques de croissance polaire et pour déterminer l'orientation des fibres curli sur la surface cellulaire et le(s) pôle(s) de croissance biologiquement actif(s).

Enfin, nous utilisons abondamment la terminologie de la fermeture éclair stérique pour désigner le motif d'entrelacement des résidus conservés tournés vers l'intérieur, mais pour CsgA, cette inter-digitation ne se produit pas dans le même plan - comme c'est classiquement le cas pour les AP - en raison de la décaler entre les brins opposés. Il est donc clair que les curli brouillent les frontières entre les polymères protéiques classiques et les fibres amyloïdes, incitant à une réévaluation de la définition d'un amyloïde fonctionnel.

Pour rechercher des homologues CsgA/B, nous avons créé une base de données locale du génome Refseq (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/bacteria/). La recherche du génome a été effectuée à l'aide de HMMER v3.3.2 avec une valeur seuil de 1e−5, en utilisant les modèles de Markov cachés de profil organisé de Dueholm et al. les entrées en double ont été supprimées. Les séquences répétées de Curlin ont été extraites à l'aide d'une série de recherches consécutives d'expressions régulières. Tout d'abord, nous avons recherché les motifs X6QX10Q (regex :.{6}Q.{10}Q), puis nous avons recherché de manière itérative les motifs NX5QX9 (minimum de 22 résidus) qui n'ont pas le deuxième Q, mais qui ont un N en position 1 (regex : ([az]{22,})(N.{5}QG{9,})). Dans une troisième étape, nous avons également inclus des motifs dégénérés plus longs X(AIVLSTG)X(IVLQTA)xQxGx9, pour lesquels nous avons utilisé l'expression régulière suivante : ([az]{22,})(..[AIVLSTG].[IVLQTA]. QG{9,}). Toutes les séquences de répétition curlin extraites ont été compilées en un seul multi-fasta, et des logos de séquence ont été créés à l'aide de Weblogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi).

Pour l'analyse des séquences CsgB, nous avons récupéré toutes les séquences uniques de la base de données RefSeq annotées comme CsgB ou curlin mineur, supprimé leur séquence signal via Signalp640, filtré la redondance de l'ensemble de données jusqu'à <90 % de similarité de séquence par paires et supprimé toutes les entrées partielles. Pour faciliter l'alignement global et la génération de MSA, nous avons limité notre analyse aux variants CsgB avec un nombre similaire de répétitions curlin (c'est-à-dire 5 répétitions, ce qui traduit des longueurs de séquence entre 100 et 160 acides aminés pour permettre des longueurs variables de la région N22 au N -terminus).

La prédiction de la structure des protéines par lots de l'ensemble de données homologue a été effectuée à l'aide de l'implémentation localcolabfold30,31,32 (https://github.com/YoshitakaMo/localcolabfold) d'AlphaFold2 en utilisant une valeur de tolérance de 0,5, fonctionnant pour 6 recyclages et produisant 5 modèles. Les modèles ont été classés à l'aide du score pLDDT. Les modèles correspondant aux Figs. 2a, b et 3 ont été produits à l'aide du bloc-notes Jupyter AlphaFold2_advanced.ipynb sur https://github.com/sokrypton/ColabFold en utilisant Jackhmmer49, une valeur de tolérance de 0,1, 24 recyclages et la sortie de 5 modèles, et en conservant les modèles les mieux classés. Pour les prédictions multimériques, les séquences primaires des différentes sous-unités ont été concaténées et séparées par un '/'.

CsgA (P28307) et R15.5 (A0A0E3UX01) ont été clonés dans pET22b via le site Ndel sans leur séquence signal mais avec une étiquette C-terminale 6xHis-tag. L'expression a été induite dans les cellules BL21(DE3) ΔslyD par addition d'IPTG 1 mM après qu'une DO600nm de 0,6 ait été atteinte. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5000 g pendant 10 min après 1 h d'induction. Les culots ont été lysés pendant 30 min dans du tampon A (Kpi 50 mM pH 7, 2, NaCl 500 mM, urée 8 M, imidazole 12, 5 mM) et le lysat cellulaire a été centrifugé à 40 000 g pendant 30 min à 20 ° C. Après sonication pour réduire la viscosité du lysat, le surnageant a été chargé sur une colonne HisTrapTM FF (GE Heathcare Life Sciences) équilibrée dans 5 volumes de colonne (CV) de tampon A. Après lavage dans 10 CV de tampon A, la protéine a été éluée à l'aide tampon B (50 mM Kpi pH 7,2, 8 M Gnd HCl, 250 mM imidazole). Les fractions protéiques pertinentes ont été regroupées et filtrées avec un filtre de coupure de 0, 22 µm pour éliminer toute graine amyloïde potentielle et stockées à -80 ° C.

Pour éviter toute formation amyloïde indésirable dans nos solutions mères de protéines, toutes les étapes de purification ont été effectuées dans des conditions dénaturantes (urée 8 M) et les temps de manipulation à température ambiante ont été réduits au minimum absolu. Cette approche nous permet de stocker CsgA et R15.5 dans leur forme pré-amyloïde dépliée et permet de contrôler le point de départ exact de la polymérisation en passant au tampon en conditions natives, c'est-à-dire 15 mM MES pH 6,0. Pour éliminer l'urée, des colonnes de dessalage ZebaTM Spin (7 K MWCO) (Thermo Scientific) ou des colonnes de dessalage HiTrap de 5 ml (GE Healthcare) ont été utilisées.

L'imagerie TEM à coloration négative (nsTEM) des filaments R15.5 a été réalisée à l'aide de grilles de cuivre recouvertes de formvar / carbone (Electron Microscopy Sciences) avec un maillage de 400 trous. Les grilles ont été luminescentes (ELMO; Agar Scientific) avec un courant de plasma de 4 mA pendant 45 s. 3 µl de solution de filaments R15.5 assemblés in vitro ont été appliqués sur les grilles à décharge luminescente et laissés à adsorber pendant 1 min. La solution a été séchée, suivie de trois lavages avec 15 pl de Milli-Q. Après cela, les grilles ont été plongées dans des gouttes de 15 µl d'acétate d'uranyle à 2 % trois fois pendant 10 s, 2 s et 1 min respectivement, avec une étape de buvardage entre chaque trempage. L'excès de colorant a ensuite été tamponné à sec avec du papier Whatman de type 1. Toutes les grilles ont été criblées avec un microscope 120 kV JEOL 1400 équipé d'un filament LaB6 et d'une caméra CCD TVIPS F416.

Pour rechercher la validation expérimentale de l'axe de la vis à deux volets dans l'interface de la sous-unité, nous avons produit des mutants à double cystéine avec une Cys localisée en surface dans l'extrémité N- (R1 : S10C ou D21C) et C-terminal (R14 : T342C), de sorte qu'ils sont juxtaposés et à l'intérieur de la distance de liaison disulfure (CsgA S10C/T342C), ou se trouvent sur les côtés opposés de l'interface (CsgA D21C/T342C) de l'axe de la vis R15.5 (Fig. 8a supplémentaire). 100 ng de fibres purifiées produites in vitro de WT CsgA, CsgA S10C/T342C et CsgA D21C/T342C, ainsi qu'un seul mutant de cystéine de CsgBCys à l'extrémité C-terminale (X00C, comme contrôle de marquage à 100 %), le tout dans 50 mM de potassium phosphate pH 7,2, urée 8 M, tampon imidazole 250 mM, ont été mis à réagir (température ambiante 1 h) en solution avec du maléimide IRDye680 pour marquer les thiols libres. Les fibres ont été lavées 2x dans du PBS avant application (par filtration pour retenir les fibres) sur membrane de nitrocellulose et détermination du signal de fluorescence à 680 nm (avec Licor Odyssey M). L'efficacité de marquage est donnée sous forme de signal de fluorescence normalisé à celui du mutant Cys unique non oxydant CsgBCys.

Des ensembles de données cryo-EM haute résolution ont été collectés à l'aide de grilles de carbone trouées à mailles de cuivre Quantifoil ™ R2 / 1 300 recouvertes d'oxyde de graphène (GO). Pour le revêtement GO, les grilles ont été soumises à une décharge luminescente à un courant de plasma de 5 mA pendant 1 minute dans un déchargeur luminescent ELMO (Agar Scientific). Un cryo-piston Gatan CP3 réglé à -176 ° C et une humidité relative de 90% a été utilisé pour préparer les cryo-échantillons. Un total de 3 µL de solution amyloïde a été appliqué sur la grille trouée et incubé pendant 30 s. La solution a été séchée des deux côtés à l'aide de papier Whatman de type 2 pendant 3 s avec une force de transfert de 0 et congelée par plongée dans de l'éthane liquide prérefroidi à -176 ° C. Des films de micrographie 2D cryo-EM haute résolution ont été enregistrés à 300 kV sur un microscope JEOL Cryoarm300 équipé d'un filtre d'énergie Ω dans la colonne (fonctionnant à une largeur de fente de 20 eV) automatisé avec SerialEM 3.0.850. Les films ont été capturés avec un détecteur d'électrons direct K3 exécuté en mode de comptage à un grossissement de 60k avec une taille de pixel calibrée de 0,764 Å/pix et une exposition de 64,66 e/Å2 prise sur 61 images. Au total, 3960 et 4455 films ont été collectés dans une plage de défocalisation de 0,5 à 3,5 micromètres pour les curli ex vivo et R15,5, respectivement.

Tous les films à dose fractionnée ont été corrigés pour le mouvement induit par le faisceau à l'aide de MOTIONCORR2 (Zheng et al., 2017) mis en œuvre dans RELION 3.1 (Zivanov, Nakane et Scheres, 2020). La fonction de transfert de contraste (CTF) des images corrigées en mouvement a été calculée à l'aide de CTFFIND4 (Rohou & Grigorieff, 2015). 1000 filaments ont été mis en boîte manuellement à l'aide de e2helixboxer.py du package EMAN2 (Tang et al., 2007) et utilisés comme ensemble de données d'entraînement pour SPHIRE-crYOLO. Le modèle crYOLO a ensuite été utilisé pour sélectionner automatiquement les coordonnées des filaments dans tous les ensembles de données. Des particules de filaments de taille de boîte de 300 × 300 pixels ont été extraites avec un chevauchement de 10 % dans RELION. Après extraction, 341691 et 1817890 particules ont été obtenues pour ex vivo curli et R15.5 respectivement. Pour filtrer les particules non idéales, plusieurs cycles de classification 2D ont été exécutés dans RELION 4.0 avec une valeur de paramètre de régularisation T de 10, chaque exécution consistant en 50 itérations. Plusieurs cycles de filtrage ont abouti à des ensembles de données de 41 806 et 243 391 particules enrichies de curli ex vivo et R15.5 respectivement. Aucune des moyennes de classe 2D résultantes n'a montré de signes de nature hélicoïdale, à en juger par les pics de la transformée de Fourier des images de filament. Pour générer le volume 3D, trois séries de classifications 3D ont été exécutées (Fig. 16 supplémentaire). Pour la première exécution, un cylindre sans relief de 4 nm a été utilisé comme modèle initial. La classification 3D a été effectuée avec la reconstruction hélicoïdale activée (avec une montée du paramètre hélicoïdal = 72 Å et une torsion = 180 degrés), avec le paramètre de régularisation T et le nombre de classes définis sur 25 et 3 respectivement. Il en est résulté que 73,5% des particules ont été attribuées à la classe 1, par conséquent, le volume respectif a été filtré passe-bas à 20 Å et utilisé comme modèle initial pour le deuxième tour de classification 3D avec des paramètres définis de la même manière que le premier tour. Cela a conduit à trois classes 3D, composées respectivement de 66,6 %, 20,2 % et 13,7 % de particules. Le volume représentant 66,6 % des particules a été utilisé comme modèle initial pour un autre cycle de classification 3D avec un paramètre de régularisation T fixé à 50 mais sans l'application d'une symétrie hélicoïdale. À cette étape, les cartes résultantes comportaient un empilement de brins β séparés par une distance de 4,7 Å chacun dans les trois classes. Parmi les classes 3D résultantes, la classe 3 comprenait le groupe le plus important avec 49,2 % de particules qui lui étaient attribuées, mais le volume résultant était plus bruyant et discontinu dans son squelette de chaîne primaire. Au contraire, la classe 1 avec 26,3% de particules avait une connectivité de la chaîne principale de la chaîne primaire significativement meilleure. Aucune des classes n'a abouti à des cartes avec un potentiel électronique de chaîne latérale bien défini. Nous avons ensuite recentré et réextrait 64138 particules correspondant à la classe 1 et utilisé le volume filtré passe-bas respectif comme modèle initial pour le raffinement 3D. Bien que cela se soit déroulé sans aucune erreur, le raffinement 3D n'a pas conduit à une grande amélioration de la qualité de la carte. Le modèle prédit AF2 de R15.5 a ensuite été placé manuellement dans la carte raffinée et a été soumis à un ajustement de corps rigide dans ChimeraX. Les statistiques de la carte et du modèle se trouvent dans le tableau supplémentaire 1.

L'imagerie AFM à grande vitesse a été réalisée en mode tapotement à l'aide d'un AFM Nanowizard III (JPK Instruments AG) équipé d'une tête AFM à grande vitesse (version JPK-00178-H-12-0021). Comme substrat pour l'imagerie, nous utilisons des disques de muscovite de 10 mm (disques de mica AFM V1 Agar Scientific) collés avec de la colle époxy à deux composants sur un support en verre. Avant le chargement de l'échantillon (10 µM R15.5 dans 15 mM MES pH 6,0 et 1 mM CaCl2), le mica a été clivé à l'aide de ruban adhésif. Des pointes en nitrure de silicium (DNP-S10) ont été utilisées avec un rayon de pointe nominal de 10 nm et une constante de rappel de 0,06 N/m. L'approche de l'échantillon a été réalisée dans l'air pour minimiser le délai entre l'injection de CsgA et le début de l'imagerie. Afin de minimiser la force appliquée à l'échantillon pendant le balayage et de contrer toute dérive dans le système, la tension de consigne a été ajustée en continu au niveau le plus bas pour lequel le contact pointe-échantillon a été maintenu.

Pour sonder la cinétique d'agrégation de R15.5, l'intensité du signal des spectres RMN 1H 1D de 100 µM de monomères R15.5 dépliés a été suivie au fil du temps (c. Phosphate de potassium mM, imidazole 250 mM, urée 8 M, pH 7,5 au tampon McIlvaine (tampon citrate-phosphate) à différents pH (4,0 à 8,0). Les spectres 1D 1H ont été enregistrés toutes les 10 min pendant la durée totale de 10 h à 298 K sur un spectromètre Bruker Avance III HD 800 MHz, équipé d'une cryosonde TCI pour améliorer la sensibilité. La suppression de l'eau a été obtenue par sculpture d'excitation de gradient (séquence d'impulsions zgesgp). L'échantillon contenait 6 % de D2O pour la mèche. Les données RMN ont été acquises, traitées et analysées dans TopSpin 3.6 (Bruker).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les prédictions AF2 discutées dans le texte principal des Fig. 2 et 3 sont fournis en tant que données supplémentaires à ce travail. Le modèle moléculaire de CsgA R15.5 a été déposé dans la banque de données des protéines sous le code d'accession 8C50 [https://doi.org/10.2210/pdb8C50/pdb]. Le volume cryo-EM raffiné a été déposé à l'EMDB sous le code d'accession EMD-16431. Les données sources sont fournies avec ce document. Des données supplémentaires sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions Marcus Fislage et Dirk Reiter de l'installation VIB-VUB pour la microscopie cryogénique bioélectronique (BECM) et pour leur aide dans la collecte de données. Nous remercions Jolyon Claridge pour son aide dans l'extraction du génome. Ce travail a été financé par VIB, EOS Excellence in Research Program par FWO par le biais de la subvention G0G0818N à HR et G043021N à MS

Biologie structurale Bruxelles, Vrije Universiteit Brussel, Bruxelles, Belgique

Mike Sleutel, Brajabandhu Pradhan, Alexander N. Volkov et Han Remaut

Microbiologie structurale et moléculaire, VIB-VUB Centre de biologie structurale, Bruxelles, Belgique

Mike Sleutel, Brajabandhu Pradhan et Han Remaut

Centre RMN Jean Jeener, Bruxelles, Belgique

Alexandre N. Volkov

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MS et HR ont conçu le projet et rédigé le manuscrit. L'ANV a effectué une RMN H 1D. MS, BP et HR ont contribué à la congélation cryogénique, à l'imagerie cryoEM et au traitement des données.

Correspondance avec Mike Sleutel ou Han Remaut.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Hao-Bo Guo et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Sleutel, M., Pradhan, B., Volkov, AN et al. Analyse structurale et principes architecturaux des curli amyloïdes bactériens. Nat Commun 14, 2822 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38204-2

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Reçu : 23 juin 2022

Accepté : 20 avril 2023

Publié: 17 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-38204-2

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